Virus gây hại trên hoa lan là một trong những yếu tố chính dẫn đến thiệt hại kinh tế cho người trồng lan. Việc phát triển một quy trình để phát hiện sớm các virus gây hại là cần thiết để đưa ra định hướng xử lý ngăn ngừa sự lây lan. Mục đích của nghiên cứu này là phát triển quy trình multiplex RT-PCR để phát hiện nhanh đồng thời 2 virus CymMV và ORSV gây hại trên cây hoa lan. Kết quả tối ưu hóa quy trình multiplex RT-PCR cho thấy, với 30 chu kỳ lặp lại và nhiệt độ bắt cặp Tm của primer là 63°C là điều kiện tối ưu nhất, cho các sản phẩm PCR có chất lượng tốt nhất. Kết quả sử dụng quy trình multiplex RT-PCR trên 30 mẫu lan đã phát hiện 20 mẫu nhiễm CymMV, 4 mẫu nhiễm ORSV, trong đó có 4 mẫu nhiễm đồng thời CymMV và ORSV. Kết quả phát hiện virus từ quy trình multiplex RT-PCR tương đồng và hoàn toàn trùng khớp với kết quả phát hiện virus từ quy trình simplex RT-PCR. Quy trình multiplex RT-PCR có thể được sử dụng để phát hiện đồng thời 2 loại virus gây hại trên cây hoa lan, giúp giảm thời gian và chi phí phân tích.